X-gal （5 - 溴 - 4 - 氯 - 3 - 吲哚基 -β-D - 半乳糖苷）(5g)

  X–gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝色。基于这个特点，pUC系列载体DNA（或其他带有lacZ基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。

CAS：7240-90-6

中文名称：5-溴-4氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷

英文名称：X-GAL

分子式

C14H15BrClNO6

分子量

408.63

溶解性

Soluble in DMF/DMSO

纯度

≥98%

外观(性状)

White to off-white Solid

储存条件

Powder:-20℃，2 years;Insolvent(母液):-20℃，6 months;-80℃，1 year

作用机制

X–gal 的核心作用是作为 β- 半乳糖苷酶的底物，通过酶促反应产生可观测的蓝色信号，具体过程如下：

1. 当细胞或生物样本中存在功能性 β- 半乳糖苷酶时，酶会特异性识别 X–gal 的 β-D - 半乳糖苷键并将其水解；

2. 水解后生成两个产物：5 - 溴 - 4 - 氯 - 3 - 吲哚酚（indoxyl） 和 β-D - 半乳糖；

3. 吲哚酚在氧气存在下会自发二聚化，形成5,5'- 二溴 - 4,4'- 二氯靛蓝（dibromo-dichloro-indigo），这是一种不溶于水的深蓝色沉淀，可在细胞或菌落中积累，从而通过肉眼或显微镜观察到蓝色信号。

使用方法

1. 溶液配制

• 储存液：用 DMF 或 DMSO 溶解 X–gal，配制成 20 mg/mL 的浓缩液，分装后于 **-20℃避光保存 **（避免反复冻融，可稳定 6 个月以上）。

• 工作液：使用前用缓冲液（如 PBS、细胞培养基或专用染色液）稀释储存液，终浓度通常为0.2-0.5 mg/mL，并加入 IPTG（终浓度 0.1-1 mM，用于诱导 lacZ 表达）。

2. 染色步骤（以细胞染色为例）

1. 细胞固定：用 4% 多聚甲醛室温固定 10-15 分钟，PBS 洗涤 2-3 次；

2. 透化处理（可选）：若检测胞内 β- 半乳糖苷酶，可用 0.1% Triton X-100 透化 5 分钟，增强底物渗透性；

3. 染色：加入 X–gal 工作液（含 IPTG），37℃避光孵育数小时至过夜（根据信号强度调整时间，通常 4-16 小时）；

4. 终止与观察：用 PBS 洗涤去除染色液，显微镜下观察蓝色信号（无需复染，蓝色信号直接可见）。

注意事项

1. 溶解性与稳定性：

• X–gal 难溶于水，必须用 DMF 或 DMSO 溶解，且储存液需避光保存，避免光照导致分解；

• 工作液需现配现用，长时间放置可能因水解失效。

2. 毒性与操作安全：

• X–gal 对皮肤、眼睛有刺激性，操作时需戴手套和护目镜；

• 其代谢产物可能具有潜在毒性，实验废弃物需按化学危险品处理。

3. 染色条件优化：

• 显色时间需根据样本中 β- 半乳糖苷酶的活性调整，过短可能信号弱，过长可能出现非特异性染色；

• 细胞衰老检测时需严格控制 pH 为 6.0，避免中性条件下正常细胞的 β- 半乳糖苷酶干扰结果。

4. 与其他实验的兼容性：

• X–gal 染色后的样本可进行后续的免疫荧光或组织切片分析，但需注意蓝色信号可能与某些荧光通道（如 DAPI 的蓝色荧光）重叠，需合理选择检测方法。

5. 重要提示

6. 产品用途：仅供研究使用，不适用于人或动物的体外诊断与治疗。

7. 由于实验受多种因素影响具有不确定性，本说明书操作说明仅供参考，最终解释权归本公司所有。

主要实验应用

1. 蓝白斑筛选（重组质粒克隆筛选）

这是 X–gal 最经典的应用，常用于基于lacZ 基因互补的克隆筛选：

• 实验室常用的大肠杆菌宿主菌（如 DH5α）多为lacZΔM15突变体，其自身无法合成完整的 β- 半乳糖苷酶，但含有 lacZ 基因的 α 肽段；

• 用于克隆的载体（如 pUC 系列、pBluescript 系列）携带 lacZ 基因的启动子和 α 肽段编码区（lacZ'）；

• 当载体未插入外源 DNA 时，载体的 lacZ' 与宿主菌的 lacZΔM15 互补，可形成功能性 β- 半乳糖苷酶，催化 X–gal 水解产生蓝色菌落（蓝斑）；

• 当外源 DNA 插入载体的多克隆位点（位于 lacZ' 内部）时，lacZ' 被破坏，无法形成功能性酶，菌落呈白色（白斑）；

• 实验中需同时加入IPTG（异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷），其作为 lac 操纵子的诱导剂，可激活 lacZ' 的表达，增强显色效果。

2. 基因表达与启动子活性分析

• 若将目的基因启动子与lacZ 基因融合构建报告基因载体，通过检测 X–gal 显色强度，可间接反映启动子的活性或目的基因的表达水平：

• 在细胞实验中，转染重组载体后，用 X–gal 染色，蓝色信号的分布和强度对应启动子活性的时空变化；

• 在模式生物（如小鼠、果蝇）中，通过 lacZ 转基因标记特定细胞类型或组织，X–gal 染色可直观显示其分布（如发育生物学中追踪细胞谱系）。

3. 细胞衰老检测

• 衰老细胞的 β- 半乳糖苷酶活性会升高（且最适 pH 偏酸性，约 pH 6.0），利用这一特性，可通过X–gal 酸性条件染色检测衰老细胞：

• 实验中需将染色缓冲液 pH 调至 6.0，衰老细胞会被染成蓝色，常用于细胞衰老模型的验证或组织中衰老细胞的定位。