关于胎牛血清沉淀问题

一.血清沉淀产生的根本原因

  血清由于是采自活体牛，属于纯天然复合物，成分非常复杂，以目前的科技手段仍无法完全明确其成分。虽然在生产过程中已经经过0.1um过滤，但在后期使用过程中，仍或多或少会出现析出沉淀等现象。血清沉淀的形成机理多种多样，具体的机理尚不完全明确，大致原因是解冻温差过大，保存不当，反复冻融或长时间室温放置导 致。

血清沉淀主要有哪些及主要原因和解决方案：

1. 脂蛋白复合物聚集：

   · 主要来源： 这是最常见的沉淀类型。血清中含有丰富的脂类（胆固醇、甘油三酯、磷脂等）和运输它们的脂蛋白（如LDL, VLDL）。

   · 形成机制： 在冷冻过程中，水形成冰晶，导致溶液中溶质浓度急剧升高（尤其是盐分和脂蛋白）。高盐浓度和低温环境破坏了脂蛋白的稳定性，使其变性、聚集并沉淀出来。反复冻融会显著加剧这个过程。

   · 形态： 通常呈絮状、云雾状或细小的颗粒，颜色可能为白色、灰白色或浅棕色。解冻后摇晃或搅动血清，这些沉淀通常会暂时均匀分散，但静置后会再次沉降到底部。

2. 磷酸钙结晶：

   · 主要来源： 血清中含有较高浓度的钙离子和磷酸根离子。

   · 形成机制： 在冷冻或储存过程中，特别是在pH值轻微升高或局部浓度过高时（冷冻浓缩效应），磷酸钙的溶解度降低，从而析出形成结晶。

   · 形态： 通常是细小的、闪光的白色结晶或颗粒。解冻后摇晃不易分散。

3. 纤维蛋白原/纤维蛋白：

   · 主要来源： 血清中残留的凝血因子纤维蛋白原。

   · 形成机制： 在血清制备过程中，凝血过程被激活但未完全完成，导致少量纤维蛋白原残留。在储存或解冻过程中，这些纤维蛋白原可能转化为不溶性的纤维蛋白，形成沉淀。这通常发生在制备或处理不当的血清批次中，相对较少见。

   · 形态： 可能呈纤维状、丝状或凝块状。有时会被误认为是微生物污染。

4. 其他蛋白质聚集： 在极端条件（如反复冻融、过热、pH剧烈变化）下，其他血清蛋白也可能发生变性聚集形成沉淀。

5.油脂颗粒：部分情况下，存在油脂类物质析出，大部分肉眼不可见，显微镜下可见黄色规则圆形颗粒。

储存温度和时间：

   · -20°C： 这是最常见的血清储存温度，但在此温度下，血清其中的物理化学变化（如脂蛋白变性聚集）会缓慢持续进行，导致沉淀随储存时间延长而增多。

   · -80°C： 能更好地抑制沉淀形成，长期储存推荐此温度。但即使是-80°C，经过非常长时间的储存（数年），也可能出现少量沉淀。但在存放及使用前需要注意梯度升降温。另外超低温存放对瓶子会有所影响，存在部分瓶口松动，炸裂等风险。

   · 4°C： 仅适合短期存放（几周），长期存放会导致大量沉淀形成和血清成分降解。

   · 反复冻融： 是加速沉淀形成的最主要人为因素。每次冻融循环都会加剧冷冻浓缩效应和脂蛋白变性。收到后建议分装保存或买本公司免分装产品。

加入到培养基过程中或后期析出

  这种情况下多数与温差太大，PH,渗透压差距大，还有培养基里面部分成分和血清发生反应有关。这种情况相对较少，如特别明显，建议排查下培养基相关指标，缓慢加入，适当调节渗透压，ph值等改善。

二、沉淀的影响

1. 物理干扰：

   · 堵塞滤膜： 在无菌过滤血清或含有血清的培养基时，沉淀物极易堵塞滤膜（尤其是孔径较小的0.22µm或0.1µm滤膜），降低过滤效率，甚至导致过滤失败。

   · 堵塞移液管/针头： 吸取含沉淀的血清时容易堵塞移液器吸头或注射器针头。

   · 影响细胞观察： 显微镜下观察细胞时，沉淀颗粒可能被误认为是细胞碎片或污染物，干扰对细胞状态的判断。

2. 潜在干扰： 虽然大部分研究表明这些沉淀本身对细胞生长没有直接毒性（细胞通常不摄取或利用它们），但在进行某些精细实验（如蛋白质组学、代谢组学、某些酶活性检测、高灵敏度成像）时，大量沉淀的存在可能在物理上或化学上干扰实验结果。

3. 心理影响/误判： 沉淀的存在可能让使用者担心血清被污染（如细菌、真菌、支原体）或已失效。

三、如何区分沉淀与污染？

· 形态： 脂蛋白沉淀通常均匀、絮状；磷酸钙结晶细小闪光；纤维蛋白呈丝状。微生物污染（细菌、真菌）通常有菌落特征（点状、毛状），且会增殖。

· 显微镜观察： 在相差显微镜或普通光学显微镜下观察未染色的样本。沉淀通常是无定形颗粒或结晶，没有特定的细胞结构。细菌、真菌、支原体有其特定的形态和运动方式。

· 培养检测： 进行无菌试验（接种到肉汤或琼脂培养基中培养）可以明确是否存在微生物污染。沉淀不会生长。

· 溶解性： 某些沉淀（如部分脂蛋白）在37°C水浴中温热并轻柔摇晃可能部分溶解或分散得更均匀。污染物不会溶解。

四、如何处理含沉淀的胎牛血清？

1. 预防为主：

   · 避免反复冻融： 这是减少沉淀形成的最关键措施！购买后应立即根据每次实验的用量进行分装（如50ml离心管分装成5ml/管），储存于-20°C。使用时取出一管解冻，并在4°C短期保存（通常建议1个月内用完）。

   · 规范解冻： 将冻存的血清置于4°C冰箱缓慢解冻过夜（首选），或置于室温（20-25°C）水浴中轻轻摇晃加速解冻。切勿在37°C水浴中快速解冻，高温会加速蛋白变性和沉淀形成。

   · 规范储存： 长期储存务必在-20℃到-80°C。解冻后短期存放于4°C（避免冷冻）。解冻血清时，请按照逐步解冻法(-80℃到-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度，太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。

   · 轻柔操作： 解冻后和使用前，轻柔地摇晃或颠倒混匀血清，避免剧烈摇晃产生气泡和剪切力破坏蛋白。

    非必要不要热灭活：血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

2. 沉淀出现后的处理：

   · 直接使用： 如果沉淀量少且实验对沉淀不敏感（如常规细胞培养），可以轻柔混匀血清后直接吸取上清液使用（避免吸取底部的沉淀）。这是最常用的方法。部分沉淀在加入到培养基后会出现溶解现象。轻微沉淀会自行溶解于培养基中。

   · 离心去除：

     · 将血清解冻并轻柔混匀。

     · 在4°C下，以2000-4000 x g的离心力离心10-15分钟。

     · 小心吸取上清液（避免扰动沉淀），转移到新的无菌容器中。

     · 优点： 快速去除大部分沉淀颗粒。

     · 缺点： 可能无法去除非常细小的颗粒（如磷酸钙结晶）；高速离心产生的剪切力可能对一些敏感分子有影响（尽管通常影响不大）；增加操作步骤和污染风险。

   · 过滤去除：

     · 这是去除沉淀最彻底的方法，尤其适合对沉淀要求严格的实验或血清中沉淀较多时。

     · 使用低蛋白吸附的滤器（如PES或PVDF膜）。

     · 推荐使用0.1 µm孔径的滤膜进行过滤。0.22µm滤膜通常用于除菌，但可能无法有效拦截所有细小的沉淀颗粒（尤其是磷酸钙结晶）。0.1µm滤膜能更有效地去除这些细小颗粒，但过滤速度会慢一些，且需要确认滤膜能承受压力。

     · 过滤前血清应已解冻并达到室温（或4°C），以减少滤膜堵塞。如果沉淀很多，可先低速离心去除大块沉淀后再过滤上清液。

     · 过滤过程严格无菌操作。

     · 优点： 去除彻底。

     · 缺点： 操作相对繁琐费时；滤膜成本；大量沉淀易堵塞滤膜。

五、重要注意事项

1. 沉淀≠污染/失效： 血清中出现沉淀是物理化学变化的正常结果，绝大多数情况下不代表血清被污染或失去促细胞生长能力。只要血清来源可靠、储存运输规范、无菌检测合格，其培养效果通常不受沉淀的显著影响。

2. 浑浊≠沉淀： 如果血清在储存或处理过程中被怀疑有污染风险（如容器破损、温度异常波动，厂家生产不规范），会有污染现象，血清解冻后如果整瓶出现浑浊，变色，不透明，比如颜色变暗变黑，有菌落等，大概率已经污染，建议开封前联系厂家先核实。怀疑污染时，应进行无菌检测或更换新批次血清。

3. 分装是关键： 避免反复冻融是减少沉淀最有效的方法，分装是保障。分装一定注意无菌操作，分装前将血清颠倒均匀，建议分装瓶留出一定空间，避免完全结冰后涨破容器。不建议使用离心管，离心管密封性较差，温差过大的情况下会出现盖子和瓶体松动现象。

4. 厂商说明： 不同厂商、不同批次的血清沉淀程度可能不同。购买时和出现沉淀时，可参考厂商提供的产品说明书或咨询技术支持。

总结

  胎牛血清中的沉淀主要是冷冻和储存过程中脂蛋白变性聚集、磷酸钙结晶析出等物理化学变化的结果，是常见现象，通常不影响血清的基本促生长功能。本公司出售的胎牛血清，各项指标均在正常范围内，出厂前已严格检测，正常保存解冻的情况下，很少有析出现象。个别少量析出可按以上参考意见进行处理。