如何避免细胞污染

在细胞培养中，污染是导致实验失败的首要因素。避免污染的核心在于严格执行无菌操作、规范环境管理、合理使用试剂并建立监测体系。以下是系统化的防控策略：

一、环境与设备管理

1. 实验室分区与流向

区域 要求

准备区 独立空间，用于培养基配制、耗材灭菌（禁止带入细胞操作间）

缓冲间 更换无菌服、鞋套，进行手部消毒（75%乙醇喷雾）

核心操作区 仅放置超净台、培养箱、显微镜，限制人员流动（建议≤2人同时操作）

2. 超净工作台操作规范

· 紫外消毒：使用前开启紫外灯≥30分钟，关闭后等待10分钟再进入（避免臭氧损伤细胞）

· 气流保护：操作时保持玻璃窗高度在20-25cm（低于安全线会破坏风幕完整性）

· 台面布局：

    ✅ 清洁区：中央操作区（放置培养皿/瓶）

    ❌ 污染区：边缘区域（废弃物暂存处，与操作区间隔≥15cm）

二、无菌操作关键技术

1. 个人防护与行为准则

操作环节 规范动作

手部消毒 75%乙醇喷洒手套（操作中每30分钟重复一次）

物品传递 试剂瓶进入超净台前用乙醇喷洒表面，火焰灼烧瓶口（玻璃制品）

移液器使用 吸头避免触碰瓶口内壁，液体沿管壁缓慢加入（防飞溅）

培养瓶开盖 瓶盖内面朝上放置，禁止触碰台面

2. 液体操作防污染技巧

· 培养基/血清解冻：水浴前用封口膜密封管口（防水渗入）

· 抗生素使用：

    ⚠️ 双刃剑效应：常规培养不建议添加抗生素（掩盖轻微污染，干扰细胞代谢）

    ✅ 适用场景：原代培养、珍贵细胞系可短期使用（如青霉素50-100 U/mL + 链霉素50-100 μg/mL）

三、试剂与耗材质量控制

1. 关键试剂验证

试剂类型 污染风险 防控措施

血清（FBS） 选择正规厂家，分装过程主要污染，可选择免分装产品

胰酶 细菌内毒素 分装冻存，避免反复冻融

细胞冻存液 DMSO吸湿性导致污染 使用无菌DMSO原液，现配现用

2. 耗材灭菌标准

· 玻璃制品：高压灭菌121℃ × 30分钟（建议独立包装）

· 塑料耗材：

    ✅ 出厂预灭菌：直接使用（勿提前拆包装）

    ❌ 重复使用耗材：禁止（如移液管、培养瓶）

四、培养过程监控

1. 污染快速识别表

污染类型 肉眼观察 显微镜特征 确认方法

细菌 培养液24h内变黄/浑浊 大量微小颗粒运动 革兰染色

真菌 漂浮白色菌团 丝状菌丝或酵母样出芽 乳酸酚棉蓝染色

支原体 培养液无变化 细胞间隙黑点样颗粒，细胞变圆脱落 PCR检测（如MycoAlert™）

黑胶虫 培养液轻微浑浊 布朗运动的黑色小点（0.1-0.5μm） 0.22μm过滤排除。目前定义存在争议，仅供参考。

2. 主动监测流程

· 空白对照：每周放置1瓶未接种细胞的培养基（检测试剂污染）

· 定期检测：

  · 支原体：每2个月PCR检测一次

  · 交叉污染：STR分型（珍贵细胞系）

五、污染应急处理

1. 立即隔离：

   · 污染培养物封口后移出操作区

   · 超净台用5%过氧乙酸擦拭，紫外消毒2小时

2. 污染源追溯：

   · 检查同批次试剂/耗材

   · 复核操作记录（重点排查新手操作时段）

3. 细胞抢救：

   · 抗生素冲洗法（仅限细菌污染）：

          用含10×常规浓度抗生素的PBS冲洗细胞3次 → 更换新培养基

   · 漂洗过滤法（支原体污染）：

          细胞胰酶消化 → 0.22μm滤膜过滤 → 重铺培养

⚠️ 必须丢弃的情况：真菌污染、病毒污染、耐药性细菌污染

六、防污染终极清单

✅ **环境管理**  

   - 每周用0.1%新洁尔灭擦拭地面/台面  

   - 培养箱水盘加无菌蒸馏水（含0.1%硫酸铜抑菌）  

✅ **设备维护**  

   - CO₂培养箱每月高温灭菌（170℃ × 2小时）  

   - 生物安全柜每年风速/过滤检测  

✅ **细胞操作**  

   - 冻存细胞复苏后单独培养2周（确认无污染再扩大）  

   - 不同细胞系操作间隔用乙醇烧灼镊子  

✅ **习惯养成**  

   - 超净台内禁止说话/咳嗽  

   - 实验记录本不放入操作区

关键总结

细胞培养防污染的本质是将无菌意识转化为肌肉记忆。最有效的措施往往最简单：

1. 空间隔离：严格区分清洁区与污染区；

2. 动作精简：减少手部跨越操作区域；

3. 及时监控：发现异常立即处理（犹豫48小时污染扩散风险增加10倍）。

   牢记：超净台不是灭菌柜，而是无菌保护区——你的操作决定它的防护效果。